黄金时代的发现

20世纪80年代末与90年代初，伴随着多聚酶链式反应(PCR)技术的出现，分子生物学进入黄金时代。而在此之前，高效率扩增DNA序列是不可能的。PCR的出现让基因的克隆进入井喷时期。1991年，美国哥伦比亚大学的Axel教授与Buck博士利用PCR方法发现了庞大的嗅觉受体基因家族，并于十多年后因此一起获得诺贝尔医学与生理学奖。1992年，在美国德克萨斯大学西南医学研究中心，年仅36岁的Tom Sudhof博士已经拥有了自己的实验室，成为助理教授。他是一位生物化学家，但是却对神经科学非常感兴趣，他决心用自己学到的生物化学和最新的分子生物学方法来研究复杂的大脑。怎么入手呢？

故事要从突触说起。我们大脑中的主要细胞——神经元是如何相互通讯的呢？1897年英国神经生理学家Sherrington提出了“突触”的概念。他通过当时非常有限的神经生理学知识，创造性地提出：神经元之间通过一种叫作突触的结构来相互通讯，而并非直接连通(图1)。至于突触有什么特性，怎么组成，这些问题是一百多年后通过分子生物学的手段来解决的。

【图1　突触(李叶菲图)】

年轻的Sudhof博士雄心勃勃地要用生物化学的方法来解开突触的奥秘。当时已经知道突触是细胞膜的脂双层结构，上面有一些神经递质受体，但是突触之所以能够形成，仿佛不是神经递质受体的作用，因为神经递质传导通常发生在神经元的突触连接建立完成的时刻，那么究竟是什么信号诱导了突触连接的形成呢？Sudhof博士认为，一定是突触上面有一些跨膜的蛋白质，介导了前一个神经元与后一个神经元形成突触，然后突触传导才能够发生。

怎样找到这些微小突触上的跨膜蛋白呢？他们使用了一种非常巧妙的方法，借助黑寡妇毒蜘蛛的力量。毒理学家们从黑寡妇毒蜘蛛的毒液中分离出一种蛛毒素(latrotoxin)，并应用电生理学的方法知道蛛毒素可以非常强烈地诱导突触的递质发放而使生物体的神经末梢瘫痪，这就是毒蜘蛛致命毒液的奥秘。Sudhof博士想，蛛毒素本身是一种蛋白质，它之所以能够诱导突触的递质发放，是否是蛛毒素作用在了突触上的某种蛋白质上而产生的效应呢？应用高超的生物化学技术，Sudhof博士用蛛毒素蛋白做亲和层析的诱饵，在大脑样本中纯化到了很多与蛛毒素蛋白相互作用的蛋白，接着对这些肽段进行分析以后得到可能的DNA编码序列，应用简并探针进行PCR的扩增，从基因文库中扩增到了一个神奇的基因，这个基因编码的跨膜蛋白质位于神经突触的突触前部分，确实与突触递质释放关系密切。Sudhof博士给这个蛋白起了一个很文艺的名字—Neurexin，不知后缀-xin是否是为了纪念蛛毒素的功绩[1]。

在发现了Neurexin后，Sudhof博士越战越勇，继续用Neurexin作为诱饵，用生物化学的方法发现了Neurexin蛋白在突触后的配体——neuroligin[2]。从此神经突触最重要的粘联蛋白家族终于揭开了神秘的面纱。这个neurexin-neuroligin家族拥有众多的家族成员，结构复杂功能重要，引无数生物学家竞折腰。笔者原以为Sudhof博士会因为发现了这个神秘突触粘联蛋白家族而获得诺贝尔奖，没想到Sudhof博士却因为另外一个重要发现“突触前的囊泡转运蛋白”刚刚在今年获得了诺贝尔医学与生理学奖。造化弄人，Sudhof博士在接到斯德哥尔摩的电话时的第一反应居然是，“你不是开玩笑吧！”享受诺贝尔奖荣光的同时，我们期待Sudhof博士会继续20年前发现neurexin-neuroligin的传奇。

突触与自闭症

在发现了neurexin-neuroligin家族之后，Sudhof博士的团队很快发现位于突触后结构的neuroligin蛋白与突触后的骨架蛋白PSD95有非常强的相互作用[3]。那么neurexin与neuroligin蛋白家族究竟与突触的形成有什么关系呢？这时在美国哥伦比亚大学的Scheiffele博士实验室与华盛顿大学的Craig博士实验室发表了一系列里程碑式的文章，证明neurexin与neuroligin家族确实对于突触的形成有非常重要的作用(图2)[4-6]。

【图2　neurexin-neuroligin 在突触中的重要功能(李叶菲图)】

在神经生物学家正在为揭开neurexin-neuroligin家族的神秘面纱如痴如醉的时候，一篇法国科学家发表在《自然- 遗传学》上的论文一下子让neuroligin家族成为自闭症研究领域的焦点[7]。法国的遗传学家们在对多个患有自闭症的家系进行基因测序的分析中，意外地发现位于X染色体上的neuroligin3与neuroligin4基因在自闭症病人中都发生了突变。同一个研究组于2007年又发现另外一种突触中的重要骨架蛋白编码基因Shank3的突变也与自闭症紧密相关[8]。自闭症这种复杂的神经系统疾病难道是突触的功能发生异常而导致的么？

让我们简单聊聊自闭症的疾病特点，Kanner医生在1946年发表在《美国精神病学》期刊上的一篇论文，第一次描述了“自闭症”这种疾病[9]。Kanner医生发现有一类小朋友，具备一些独特的行为特征：不喜欢与外界交流，通常自己玩耍，反复地做同样的一些事情或同样的动作，而且常常有语言障碍，无法正常表达自己的想法或者只能说一些简单的音节与词语。因此我们可以将自闭症的症状归为3个重要方面：交流沟通缺陷、重复刻板行为与语言发育缺陷。自闭症的症状有轻重之分，严重的自闭症病人完全无法与人交流，而且往往因为无法经过足够的教育得到改善而很难融入到社会中去。在意外死亡的自闭症病人的大脑中进行的解剖研究也没有发现自闭症病人的大脑中有任何病变，既不像阿尔兹海默病人中有淀粉样沉积和病变，也不像帕金森病人那样缺失某一类神经元比如多巴胺能神经元，等等。

因此，对于自闭症的研究在分子生物学和分子遗传学兴起之前，一直停留在假说与猜想阶段，有些科学家认为自闭症与遗传因素有关，因为双生子中一个出现自闭症，另外一个出现自闭症的几率大大增加。但是还有一些科学家认为自闭症完全是后天的外界因素导致的，甚至与孕期的过敏或母亲的免疫失调有关。必须指出的是，这些猜想都没有足够的实验证据加以支持。而20世纪90年代分子生物学手段的兴起，加上人类基因组计划的开展，使得对疾病的基因突变研究大大加快。

经过对大量自闭症病人的遗传筛选，科学家们已经可以基本确认自闭症与遗传因素关系最为密切，有一系列重要基因被发现在自闭症病人中发生了突变，例如neuroligin、neurexin、shank3等等，而很多在自闭症病人中发生了突变的基因，都是与突触功能密切相关的。因此，对于自闭症的神经生物学研究，必须紧紧围绕着突触展开。因此，当我们回头看为什么自闭症病人大脑中没有出现明显的病变的时候，也就会明白，与老年痴呆症或帕金森症此类由神经元的病变、死亡导致的疾病不同，自闭症是一种神经突触功能异常导致的疾病。当我们明白了这点之后，就可能对这些异常来针对性地设计药物，对自闭症进行针对性的治疗。

自闭症的动物模型研究

通过对自闭症进行近十年的遗传学研究，遗传学家发现自闭症并非单一基因致病，有很多基因都被发现在自闭症病人的基因组中发生了突变，但是并没有一种或几种基因占主导地位(图3)。科学家们于是想，这些在自闭症病人中发生了突变的几十种甚至上百种基因，它们之间是否有内在的联系呢？经过生物信息学的分析，科学家们已经陆续发现了自闭症致病基因之间确实有一些内在联系，从而解释了为什么不同的基因突变会导致同一种疾病[10]。

【图3　自闭症病人遗传因素图(李叶菲图)】

但是，一个非常重要的问题还没有回答，这些在自闭症病人中发现突变的基因，它们是否真的是导致自闭症的罪魁祸首呢？虽然这些基因突变导致重要蛋白质的结构与功能改变，但是因为它们大多出现散发的状态，就是说一个自闭症病人基因组中找到的突变往往极少可能会在另外一个自闭症病人的基因组里找到。因此，从统计学及遗传学上，我们无法知道这些基因突变究竟是否致病，我们需要利用生物学的方法来予以确认。

2007年，已经功成名就，成为美国国家科学院院士的Sudhof博士又做了一个重要的工作——利用现代神经生物学的手段证明了neuroligin家族之一的neuroligin3基因突变确实是导致自闭症的原因[11]。

遗传学家在对自闭症病人的遗传筛选中发现了neuroligin家族之一的neuroligin3基因在一些自闭症病人的基因组中会发生突变，这个突变仅仅会改变一个氨基酸，将451的精氨酸变成了半胱氨酸(R451C)。那么被点突变改变的neuroligin3基因编码的蛋白会不会是导致自闭症的罪魁祸首呢？Sudhof博士的团队做了一系列精湛的工作，利用小鼠遗传学的方法，将小鼠基因组上面的neuroligin3基因也做了对应的突变。于是这个小鼠就携带与人类同样的R451C突变。携带这个突变基因的小鼠，是否会像人类自闭症病人一样出现这些类似人类疾病的异常呢？科学家们用一些行为学研究方法，对这些携带突变的小鼠与正常小鼠进行比较，例如，将小鼠置于一个可以自由运动的三厢，将被实验鼠置于中间，左厢放着一个玩具，右厢放一个同伴小鼠。正常的小鼠通常会表现出更喜欢与同伴小鼠待在一起打打闹闹，而非与玩具玩耍，但是携带了neuroligin3 R451C突变的小鼠则没有对同伴小鼠表现出更多的兴趣，表现出对同伴与玩具“一视同仁”。这表示携带突变的小鼠没有像正常小鼠一样的社会交往行为。科学家们继续在突变小鼠的神经元中发现了异常，他们发现这种neuroligin3 R451C突变非常特异性地影响了神经元之间的抑制性突触连接，而造成神经元网络发生功能紊乱。这个里程碑式的工作除了证明突触异常很有可能是导致自闭症的原因以外，还指明了针对相应的突触异常来设计药物来治疗自闭症的新方向。

自闭症的科学研究：昨天、今天和明天

自闭症是一种非常复杂的疾病，是人类社会的巨大挑战。迄今为止，还没有哪种疾病影响如此之广，而又难找出病因。自闭症与神经系统功能的密切相关也常常令人浮想联翩，我们的社会交往行为、性格、个性，甚至思想等等，是否，或者在多大程度上由我们的基因决定？

以前对于自闭症的研究仅仅只能局限于假说与理论推导，现代生物学的发展已经可以让我们进行大规模的基因组测序来找到可能的致病基因致病突变，然后利用现代生物学的手段研究发生了突变的基因怎样影响神经系统的功能，甚至按照人类的突变去制造动物模型来研究基因突变致病机制，同时，也推动了治疗方法平台的创立。今后，对于复杂疾病的研究必将涉及多种生物学、医学及工程学手段。研究每一种复杂疾病的同时也为人类了解自身提供了一把难得的钥匙。尤其是对自闭症这种神秘疾病的探索，面对着一无所知的黑暗地带，我们不能瞻前顾后而应不为未知所惧，奋勇前进，在攻克一个又一个未知的科学堡垒的同时造福大众，为促进大众健康尽到自己的一份力量。

关于本文

本文已发表于《生命的化学》