本文作者：生命的化学
文/李小泉，中国科学院神经科学研究所，博士，助理研究员，Email: lxq1248@gmail.com
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一种在当今生命科学和医学研究中被广泛使用的示踪物。它的出现彻底改变了科研人员的实验策略，基于GFP的光学成像技术使人们可以直接观察到从微观到宏观各个层次上丰富多彩的生命现象。因在发现和研究绿色荧光蛋白方面作出杰出贡献，下村修(Osamu Shimomura)、马丁·查尔菲(Martin Charfie)与钱永健(Roger Tsien)分享了2008年的诺贝尔化学奖。细细品味GFP的发现与发展，笔者深切地感受到这个过程可以与任意一部好莱坞大片相媲美，开篇充满惊险，中间出现惊奇，结尾一马平川。虽然之前已经有一些同样话题的文章，但是笔者依然想抛开晦涩的科学细节，用更加通俗的语言来与大家分享这一切，希望大家能从中感受到科学发现过程中的惊喜与快乐。
绿色荧光蛋白的发现——来自大海母亲的意外礼物
生命源自大海。即便在现代科学如此发达的今天，大海仍是未知的世界。相信广大读者和笔者一样，都从火爆异常的《少年派的奇幻漂流》中领略了大海令人恐怖的疯狂和叫人窒息的美丽。笔者深深地记得影片中一个异常美丽的镜头，少年派和理查德-帕克漂浮在黑夜平静的海面上，海水清澈的跟透明一般；海里漂浮着绿色的亮点，像无数飞舞在寂静夜空中的孔明灯；突然一只巨大的鲸鱼冲出水面，把平静的海面打碎，派也被掀翻到海里。在这个迷人的场景中，绿色的亮点是一种水母， 大海母亲送给人类的礼物——绿色荧光蛋白，就是在它体内发现的。
万事开头难，越是伟大的发现越是会有艰难的开始，在其中又会有很多让人揪心的偶然因素，所以在后人看来，只要这些关键节点发生的事情稍微偏差一点点，一切都会是另一番景象。绿色荧光蛋白的发现也是这样一个让人"揪心"的过程。下村修是一名日本科学家，他从小跟随非常传统的爷爷奶奶生活。作为长子长孙，他被视为家族继承人， 一言一行都会受到奶奶的严格要求，因此养成了良好的生活习惯。16岁那年，他亲眼目睹了轰炸机掠过长崎，投下原子弹后离去，留下了剧烈爆炸后的火光和强烈冲击波。幸运的是，下村修健康地活了下来。从小养成的良好生活习惯和二战中对于生死的强烈体验对下村修的秉性产生了巨大影响，使他具有坚韧不拔、百折不挠的性格和勇气，这些都是进行开创性研究必备的品格。另外，下村修从小家境殷实，这让他躲过了战时和战后的萧条期，有物质条件继续学习和深造。
经历了轰炸的长崎百废待兴，二战结束两年之后，下村修才勉强进入了一所当地的医学院(Nagasaki Phamacy College)开始学习。四年之后(1951年)他以优异的成绩完成了本科学业，留在了安永(Yasunaga)教授的实验室从事物质纯化和层析分析方面的研究。工作四年之后，安永教授决定推荐下村修到名古屋大学(Nagoya University)江上修(Igami)教授的实验室从事当年异常火爆的分子生物学研究。遗憾的是，江上修教授外出不在。不幸中的万幸，下村修得到了平田义正(Yoshimasa Hirata)教授的邀请，到平田教授的实验室工作。之后也正是因为在平田教授实验室的工作，他走上了GFP的发现之路(好险！让人揪心)。
在那个物理学家纷纷转投生物学的年代，人们对于了解生物现象的物理学基础非常感兴趣，解析各种物质的结构是大家都非常关心的话题。平田教授给了下村修一个极具挑战性的课题：为解析大名鼎鼎的荧光素(luciferin)发光原理做好基础性工作——纯化并结晶荧光素。经过很长时间的艰苦实验，下村修依然一无所获。一次深夜加班之后，他决定暂时放弃原来的实验计划，将不用的样品用做另一种分析。因为已是深夜，加好初步的试剂之后，下村修未对样品进行进一步处理就回家休息了。令人惊奇的是，第二天回到实验室，他发现试管里的荧光素结晶出来了。这不经意"偷懒"带来的成功(好让人揪心)，与费莱明发现青霉素的经历何其相似，机会真的是垂青有准备的人。
有了这样出色的研究经历，下村修收到了普林斯顿大学约翰逊(Frank H. Johnson)教授的邀请，进入这座闻名遐迩的学府，开展对水母发光机制的研究。他最初的研究集中在水母的另外一个荧光蛋白上。在那个年代，人们普遍认为生物荧光的物质基础都类似于荧光素，并非蛋白质，所以下村修和他导师开始的研究思路并没有集中在蛋白质上。经历了一系列失败之后，下村修决定跳出荧光素的思维，从蛋白质的角度来开展实验，这与他导师的研究思路产生了严重分歧。但下村修决定坚持下来，他开展了卓有成效的实验验证了自己的观点。
确定了这一点，下面的研究就围绕这一思路展开。水母是海洋生物，所以在接下来的整个夏天，下村修所在实验室的大部分精力都集中在出海收集水母、解剖和保存水母发光器官上。或许在常人看来，吹着海风，漫步海边的生活非常惬意，但现实却并非这般浪漫，日复一日的重复劳动是极考验人的一件事。在这样的坚持下，上帝又一次眷顾了下村修和他的同事。一次深夜，下村修将装有废弃样本的管子扔到了盥洗池，盥洗池里的海水倒灌进了管子，他惊奇地看到倒灌的海水使管子里的样本发出了荧光。这个意外的现象使得他发现，这种荧光蛋白是钙离子敏感的，这也直接导致了它在接下来细胞功能成像中的大范围应用，它就是大名鼎鼎的水母光蛋白aequorin。
在分离并纯化aequorin之后，下村修对它的结构和发光特性进行了仔细的研究，意外发现纯化的aequorin发出蓝色光，但水母在自然条件下发出的却是绿色荧光。下村修和他的同事推测在水母中存在另外一种绿色荧光蛋白，这种绿色荧光蛋白将aequorin发出的蓝光进行了过滤，从而使水母发出绿色光。后来的实验证明了这点，下村修成功分离了这种蛋白质，并称之为绿色蛋白(green protein)，这就是之后大名鼎鼎的GFP；在这个基础上，下村修更进一步地对GFP的发光机理进行了初步研究，这也为后来人们对绿色荧光蛋白发光机理的全面理解夯下了坚实的基础。
之后的研究发现，GFP和aequorin在水母的发光器里发生了荧光共振转移(fluoroscence resonance energy transfer)的物理反应，GFP吸收了aequorin发出的蓝色荧光，发射出绿色荧光。下村修原本是想研究aequorin，但却找到了为生命科学带来革命性进步的GFP。这真是"山穷水尽疑无路，柳暗花明又一村"！当然，机会总是垂青有准备的头脑，在这激动人心的发现背后，是下村修和同事们扎实而勤奋不懈的工作、熟练的技术以及对生物荧光现象真正的科学兴趣。在这一过程中，他们收集的水母标本数以百万计。令人感叹的是，由于气候和环境的变化，在当年下村修们收集水母的地方已经很难看到如此多的实验标本了；如果下村修晚生十年，GFP的秘密就会被永远埋藏在浩瀚的太平洋。
原来世间真的有扫地僧——被诺奖遗忘的巴士司机
当时研究生物学现象，都是先收集大量实验材料，经复杂处理后，以化学分析的方法来观察和定量所关心的生物分子。这种方法完全失去了所研究生物分子在时间与空间上的特性，使"生物"变成"死物"，且带来了极大的工作量。GFP的运用彻底改变了这一点。在下村修工作的基础上，普瑞泽(Douglas C. Prasher)在博士研究生阶段找到并克隆了编码aequorin的基因。之后他在伍兹霍尔海洋研究所建立了自己的实验室，继续从事对生物荧光现象的研究。GFP被发现之后，普瑞泽最先意识到可以通过基因工程的方法将这种荧光蛋白连接到细胞内的各种分子上，让这些分子带上荧光尾巴，再通过光学成像对它们进行观察和定量分析，同时研究它们在时间与空间上的特性；在另一个层次上，也可以将GFP表达在特定的细胞中，通过成像的方法来观察这些细胞的运动和行为。这是一个在现在人人都知道的实验策略，但在当时却是一个革命性的想法。
1988年，普瑞泽从美国癌症学会申请到为期两年的研究经费，用于寻找并克隆编码GFP的DNA序列。在那一个基因一个博士学位(one gene, one PhD)的年代，克隆一个基因并不如现在这么容易。经过了长期的实验，普瑞泽最终成功克隆了这个基因。但遗憾的是，两年后他没有申请到别的研究经费，无法就GFP能否通过基因工程在其他生物细胞内表达开展进一步研究，他不得不关闭自己的实验室另谋生路。辗转几年后，他成了一名巴士司机，时薪不到10美元。这样，GFP在水母之外的生物中是否能够发光的研究停止了下来。虽然如此，普瑞泽依然和众多科研人员分享了他克隆出的DNA，这包括之后获得诺贝尔化学奖的马丁·查尔菲与钱永健。普瑞泽的这一贡献为后来GFP的广泛运用铺下了第一块基石。虽然没有得到诺贝尔奖委员会的认可，但是在谈到普瑞泽的贡献时，马丁·查尔菲甚至说："他们可以忽略掉我，把这个奖颁给普瑞泽。"普瑞泽也获得了马丁·查尔菲和钱永健的邀请出席诺贝尔奖颁奖仪式。虽然有着扫地僧般的名望，但现实并不像武侠小说那样潇洒；由于没有稳定的工作，普瑞泽一直过得很辛苦，为了生存而奔波。在穷困潦倒之后，普瑞泽又回到了科研领域，在钱永健的实验室任职，继续发挥他的天赋。
第一个吃螃蟹的人——勇气和运气真的很重要
在成功克隆GFP的基因之后，人们顺理成章地想到该如何使用这样一个荧光标记工具。但在当时有一个问题一直困扰着人们——GFP最终发出荧光是否需要经过水母体内特殊物质的加工？如果这种物质在其他物种中不存在，那么即便GFP成功表达了，它也不能发出荧光，通过荧光标记观察生物学过程就成了空谈。也正是因为这个原因，普瑞泽将他克隆出的GFP称为"绿色荧光蛋白前体"，意指这种蛋白质还需要未知物质的加工才能发出荧光。在这个大家都疑惑的时候，第一个成功吃到螃蟹的人出现了，他就是马丁·查尔菲。马丁·查尔菲师从大名鼎鼎的西德尼-本瑞纳(Sidney Brenna)。在生物学领域，本瑞纳是一位尚在世间德高望重的老科学家，他经历了沃森-克里克解析DNA结构那个火红的年代，因为在线虫领域开创性的工作获得了诺贝尔奖；在果蝇中他也做出了很多先驱性的工作，他是生物学领域里的"张三丰"。
名师出高徒，师从这样一位具有强大开创精神的导师，查尔菲也是一个敢于吃螃蟹的勇士。他当时是哥伦比亚大学的生物学教授，主要从事生物如何通过触觉感知外部世界的研究。1988年，他在学校参加一个关于生物发光的研讨会，在研讨会上，有人介绍了水母的发光机制和GFP在其中的作用。与普瑞泽类似，查尔菲同样意识到可以运用GFP来标记细胞并观察生物学现象，比如在线虫这种通体透明的小虫中观察基因的表达情况。在接下来的几天里，查尔菲查找了大量资料试图找到是否有人克隆了GFP的基因；他发现普瑞泽正在尝试做这件事情。与普瑞泽联系并交换想法之后，他们一拍即合，计划将GFP表达在线虫的细胞里。可惜的是当时普瑞泽并没有完成对GFP整个基因的克隆，他只得到了部分的区段。让人流汗的剧情在这个时候出现了：四年过去，普瑞泽成功克隆了全长的GFP基因，他试图联系查尔菲；遗憾的是查尔菲当时外出度假了，没有人告诉普瑞泽如何找到查尔菲，普瑞泽只好作罢。
幸运的是，在线虫中表达GFP这个想法一直留存在查尔菲脑海中。1992年，研究生一年级的GhiaEuschirken来到了查尔菲的实验室，查尔菲跟她谈了在线虫中表达GFP的想法；他们立刻去图书馆查找文献，想看看是否有新的关于GFP的工作。他们惊喜地发现，普瑞泽已经成功克隆了全长的GFP基因。查尔菲立刻拨通了普瑞泽的电话，在电话中普瑞泽告诉查尔菲，他初步尝试了表达GFP，但表达之后却没有看到荧光，有可能水母中有特殊的物质， GFP需要被这种物质加工之后才能发出荧光。虽然如此，查尔菲依然决定再试一试。于是普瑞泽将GFP的基因邮寄给了查尔菲，之后查尔菲指导GhiaEuschirken将GFP表达在大肠杆菌内；他们幸运地发现表达GFP的大肠杆菌发出了绿色荧光：原来GFP并不需要与水母中特殊的物质相互作用就能发出荧光！之后查尔菲将GFP表达在了线虫中，他也在线虫中观察到了荧光。这个工作发表在Science杂志上，成为了分子生物学与遗传学领域划时代的工作。
在谈到这段经历时，查尔菲感慨道"基因表达有很多标准策略，我们仅仅是运用了其中一种；也许对GFP来说，其他的标准策略都不能实现正常的表达。我们很幸运地成功了。"在别人失败之后，查尔菲依然尝试新事物的勇气和采用合适方法的幸运为他带来了诺贝尔奖。查尔菲成功在线虫表达GFP之后，无数的研究者开始跟他联系索取GFP的基因序列，在自己的实验系统里开展实验。GFP引领的生物学革命来临了！
织出生物学天空最美丽的彩虹——巧手夺天工的钱氏后人
山雨欲来风满楼，虽然GFP引领的生物学革命已经初现端倪，但GFP本身还不够完美，还在等着后来者对它做出进一步的改造；它就像一块璞玉，需要富有想象力的能工巧匠来打磨。华裔科学家钱永健(Roger Tsien)就是这样一个巧手夺天工的匠人。钱永健出生在一个工程师家庭，祖籍浙江杭州，用他自己的话说，他出生在一个"书香门第"。他的父亲是一个无名但学识颇高机械工程师，他的兄长是生物学领域的大牛，他的堂叔钱学森，绝大多数人都耳熟能详了。
作为一个跨领域、对改造分子情有独钟的"化学家"，在接触GFP之前钱永健就对运用显微镜技术观察生物学现象异常感兴趣。他在20世纪70年代读博士时，就设计合成了可以用光学成像来观察细胞内钙离子浓度的化合物BAPTA，这个化合物到今天仍然被广泛运用。他最初接触到GFP的来龙去脉笔者已无从了解，但在GFP被普瑞泽成功克隆的第二年(1994年)，钱永健就通过实验，解决了人们关于为何GFP在大部分生物中都能发出荧光的疑惑：他发现氧分子就是那个人们一直猜测，参与GFP加工的因子。氧分子的广泛存在使GFP可以在绝大多数生物体中形成成熟的发光基团并发出荧光。在这之后，钱永健领导的团队更加细致地解析了GFP发光的原理，人们也破解了GFP的晶体结构。
有了原始GFP这块璞玉和对它加工成熟与分子结构的认识，钱永健运用巧夺天工的设计开始了对GFP的改造。他在GFP的蛋白序列中引入突变，从发光颜色、成熟速度、发光亮度以及发光的稳定性方面对原始GFP进行了大规模的改造，让它成熟更快，发光更亮，更适合在活体生物上工作；他们还开发出了青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。在俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov中发现红色荧光蛋白之后，钱永健又对原始的红色荧光蛋白进行了改造，使它更加适合充当标记生物现象的工具。至此，可以发出不同颜色光的荧光蛋白们正式亮相，人们可以随心所欲地以赤橙黄绿蓝靛紫来标记并观察各个层次的生命现象。钱永健用他的巧手织出了生物学界最美丽的彩虹，真正拉开了生物学革命的大幕。这也为他带来了一个诺贝尔化学奖。
小小的羽毛一样可以让你飞得很高
在巧手的工匠面前没有东西是完美的，他们总是有无尽的激情与想法来打磨手中的器物，创造出在常人眼中不可思议却又异常好用的东西。GFP的发现和发展历程带给人们的不仅仅是GFP工具本身，它在方法和思路上带来的影响更为深远。在方法上，GFP诱发的革命直接带动了光学成像技术在生命科学研究中的广泛运用和飞速进步。现在人们不仅可以通过GFP及其衍生物来观察生物大分子的物理运动，还可以观察到微观粒子(如钙离子)和生物大分子生物活性的动态特征。更加让人兴奋的是，人们已经可以通过荧光蛋白，用光学成像的方法来控制生物大分子的活性。在思路上，GFP也提示人们千万不要忽略大自然中一些简单而"低等"的事物，这些事物往往蕴含着强大而直接可被人所用的工具。只要兴趣指引着我们用心去找，就会有惊喜的发现：近年来名声大噪的光通道蛋白、可变色的荧光蛋白都是这一点的明证，它们同样成为了科学家手中强有力的武器。从这些低等生物中发现的小东西，也许只是一片小小的羽毛，但是我们相信真的会有那么一天，人类的巧手可以把它们粘成巨大的翅膀，带着人类在认识与改造自然的征途上一飞冲天！
参 考 阅 读
[1] http://www.nobelprize.org
[2] Shimomura O. The discovery of aequorin and green fluorescent protein. J microsc, 2005, 217: 1-15
[4] http://www.in-cites.com/papers/DrMartinChalfie.html
[5] http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
[6] Zhou XX, Chung HK, Lam AJ, et al. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science, 2010, 9: 810-814
[7] Miyawaki A, Griesbeck O, HeimR, et al. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 2135-2214
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